CFTR对高果糖高盐诱导的高血压的调控作用及机制研究

【摘要】目的：1.建立囊性纤维化跨膜转运调节体(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)敲除小鼠模型；2.观察CFTR敲除对血压及血管功能的影响；3.探讨CFTR敲除对原发性高血压的影响及调控通路赖氨酸缺陷型蛋白激酶(with-no-lysinekinases,WNKs)和氧化应激的作用。方法：1.CFTR敲除小鼠培育杂合型的CFTR+/-小鼠购于美国Jackson实验室,雌雄各半。培育纯合型的CFT-/-和CFT+/+小鼠,测定基因型后,8-12周雄性纯合小鼠被纳入实验。本实验采用先进的遥测血压技术精确监测血压,Transmitter植入术后恢复2周开始记录血压,设置DataquestART4.3软件系统(DataScienceInternational,DSI),自动记录收缩压,舒张压,及心电图。2.高血压模型构建为研究CFTR在原发性高血压中的作用,我们构建高果糖高盐诱导的原发性高血压模型。高果糖食物和正常对照食物购于美国Harlan实验室(Madison,Wisconsin)。高果糖食物含64.7%果糖,正常对照食物含58.9%淀粉。将5g氯化钠加入到小鼠250m1饮用水中制作2%中等高盐盐水。实验分组：(1)对照鼠正常饮食组,给予正常对照食物和正常饮用水8周；(2)对照鼠高果糖高盐组,给予高果糖食物和2%盐水8周；(3)CFTR敲除鼠正常饮食组,给予正常对照食物和正常饮用水8周；(4)CFTR敲除鼠高果糖高盐组,给予高果糖食物和2%盐水8周。3.CFTR敲除对血压、血管功能、蛋白表达和氧化应激影响的评价为评价小鼠血管功能和心脏参数,Vevo2100超声仪被使用对小鼠行心脏超声和血管多普勒测定,使用Vevo2100标准测量软件包测量。采集主动脉彩色多普勒血流图并测量主动脉血流速度。采集肾动脉彩色多普勒血流图并测量肾动脉抵抗指数。我们采用实时荧光定量PCR和WesternBlot测定CFTR和WNKs表达变化情况。采用荧光探针测定组织活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)和GSH水平。为探讨进一步的机制,我们分离线粒体并使用蛋白标记物和酶标记物评价分离线粒体的纯度,使用荧光探针测定线粒体膜电位评价分离线粒体的功能,进行线粒体GSH摄取分析进一步研究相关机制。结果：1.CFTR敲除小鼠血压及血管功能的改变CFTR敲除小鼠的24小时动态血压、白天血压、夜间血压值均明显高于对照鼠,差异具有统计学意义。CFTR敲除后,24小时动态收缩压(systolicbloodpressure,SBP)升高12mmHg；24小时动态舒张压(diastolicbloodpressure,DBP)升高10mmHg。M模式超声探测主动脉根部并测量收缩期与舒张期主动脉内径值,以计算主动脉的伸展弹性,结果显示：CFTR敲除鼠主动脉的顺应性明显低于CFTR对照鼠主动脉的顺应性(12.7±2.1%对比7.4±3.0%,P<0.05)。2.CFTR敲除影响高果糖高盐引起的血压改变饮食干预明显增加了正常对照鼠的血压水平,24小时SBP增高了11.8±1.6mmHg,较喂养前和对照组相比P<0.05；24小时DBP增高了8.9±1.3mmHg,较喂养前和对照组相比P<0.05。但CFTR敲除却明显延缓了高果糖高盐诱导的高血压的发生发展。CFTR基因敲除后,高果糖高盐未引起SBP的升高,DBP从第5周起逐渐升高。3.WNK1和WNK4调控CFTR表达水平饮食干预后正常对照鼠主动脉CFTR的mRNA表达水平大约下降了90%(1±0.06对比0.1±0.02,P<0.05),肠系膜上动脉CFTR蛋白的表达水平大约下降了80%(1±0.02对比0.2±0.04,P<0.05),血管WNK1mRNA水平约下降了50%左右(1.0±0.02对比0.5±0.02,P<0.05),血管WNK1蛋白表达水平约下降了50%左右(1±0.05对比0.5±0.01,P<0.05),血管WNK4mRNA水平约下降了90%左右(1±0.05对比0.1±0.006,P<0.05),血管WNK4蛋白表达水平约下降了70%左右(1±0.08对比0.3±0.01,P<0.05)。CFTR基因敲除鼠在饮食干预后血管WNK1mRNA水平约下降了17%左右(0.6±0.02对比0.5±0.07,P<0.05),血管WNK1蛋白表达水平约下降了36%(1.4±0.04对比0.9±0.1,P<0.05),血管WNK4mRNA水平约下降了85%左右(0.2±0.03对比0.03±0.00,P<0.05),血管WNK4蛋白表达水平约下降了60%(0.5±0.009对比0.2±0.01,P<0.05)。4.CFTR敲除或表达下调对氧化应激的影响饮食干预使正常对照鼠主动脉CFTR的mRNA表达水平大约下降了90%,肠系膜上动脉CFTR蛋白的表达水平大约下降了80%,使正常对照鼠的主动脉ROS水平发现较对照组升高1.8倍(1.8±0.05对比1±0.01,P<0.05)。CFTR基因敲除小鼠主动脉的ROS水平增高至正常小鼠主动脉ROS水平的3.4倍(3.4±0.3对比1±0.01,P<0.05)。其中,CFTR敲除鼠线粒体ROS水平的增高与组织ROS增高幅度一致。结论：1.CFTR参与了血压及血管功能的调节；2.CFTR敲除对高果糖高盐诱导的血压升高具有抵抗作用；3.CFTR的表达调控通路可能与WNKs表达和氧化应激有关。
【作者】张雅娉；
【导师】袁洪；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】囊性纤维化跨膜转运调节体；血压；高血压；赖氨酸缺陷型蛋白激酶；氧化应激；

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